Nestes días de #QuedanaCasa, convulsos pola pandemia que estamos a sufrir polo coronavirus, estanse a facer populares as siglas PCR, xa que se corresponden coa técnica molecular que se emprega para a identificación das persoas infectadas. As siglas agochan o termo reacción en cadea da polimerasa, que en inglés se expresa polimerase chain reaction, é dicir, PCR. O kit DNA-Meat desenvolvido por XuvenCiencia para este curso 2019/2020 utiliza esta mesma técnica para determinar a orixe de diferentes produtos cárnicos.
A PCR foi descrita polo bioquímico estadounidense Kary Mullis en 1983 e a súa investigación neste eido valeulle o premio Nobel de Química unha década despois. A reacción en cadea da polimerasa permite a amplificación dun fragmento de ADN particular —diana— por moi pequena que sexa a súa cantidade, sempre que se coñezan as secuencias de nucleótidos que flanquean a secuencia diana de interese. Estas rexións flanqueantes permiten deseñar cebadores ou primers, necesarios para realizar a amplificación. Como os conceptos poden resultar un pouco arduos, ao final desta entrada incorporamos un pequeno glosario que seguro que vos é de moita utilidade.
A PCR reproduce in vitro a replicación de ADN. Para iso usa unha enzima que sintetiza ADN e que se denomina ADN polimerasa e, ademais, cambios de temperatura da mostra, de xeito que producen os tres pasos básicos dun ciclo de PCR:
- desnaturalización do ADN
- hibridación dos primers coas súas rexións complementarias
- copia de cada unha das cadeas por complementariedade de base nucleotídica mediante a ADN polimerasa.
A realización de múltiples ciclos —de 25 a 35— consecutivos —isto é, en cadea— permite crear millóns de copias do fragmento de ADN desexado.
Esta técnica molecular tamén se emprega no kit DNA-Meat de XuvenCiencia, unha ferramenta de trazabilidade alimentaria deseñada para coñecer a orixe de diferentes produtos cárnicos, sobre todo carnes moídas como hamburguesas. No noso kit DNA-Meat temos parellas de primers específicos para identificar a orixe porcina e bovina dos alimentos, xa que son dúas das carnes máis consumidas en Galicia.
Porén, existen algunhas diferencias metodolóxicas debido á natureza do coronavirus:
O SARS-Cov-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus-2) é o virus causante da enfermidade Covid-19 (Coronavirus disease 19). Como sucede con todos os coronavirus, o seu xenoma está formado por ARN, dunha soa cadea, e non por ADN, que ten dúas cadeas complementarias, como ocorre co xenoma ou material xenético humano e de todos os eucariotas. A técnica de PCR só é efectiva sobre moléculas de ADN de dobre cadea, que permite a copia de ambas as cadeas, de xeito que cómpre transformar o xenoma de ARN do virus en ADN. Esta reacción realízaa a transcriptasa inversa ou retrotranscriptasa, outra enzima, neste caso capaz de sintetizar unha cadea de ADN complementaria a partir dunha cadea simple de ARN.Unha vez obtida esta cadea complementaria de ADN, empréganse uns primers específicos do SARS-Cov-2. Esta técnica coñécese como RT-PCR, porque primeiro se pasa de ARN a ADN, o que se denomina retrotranscrición, e seguidamente realízase unha PCR.
Deste xeito, se un doente está infectado polo coronavirus, obteremos un resultado positivo na RT-PCR —producirase unha amplificación— a partir do frotis tomado das súas foxas nasais ou gorxa. Sen embargo, se non está infectado, o resultado da RT-PCR será negativo e non haberá amplificación.
Como unha imaxe vale máis ca un milleiro de palabras, déixovos unha infografía sobre como funciona o test de detección do coronavirus:
Infografía de Compound Interest, máis información en Agencia SINC
E finalmente, un vídeo de YouTube moi didáctico do Dr. Lluís Montoliu, investigador científico do CSIC
Espero que vos resultase interesante esta entrada no blog.
Un saúdo,
Manel Vera, profesor contratado doutor da área de Xenética da USC. Facultade de Veterinaria, Campus de Lugo.
| GLOSARIO |
| ADN bicatenario: ADN (ou ARN) de dúas cadeas complementarias unidas entre si por pontes de hidróxeno. |
| ADN monocatenario: ADN (ou ARN) dunha soa cadea. |
| ADN polimerasa: enzima que sintetiza as copias do ADN diana |
| Amplificación: obtención dun gran número de copias idénticas dun fragmento de ADN. |
| Cebador ou primer: cadeas de ADN monocatenario cunha lonxitude de entre 18-22 pares de bases complementarias ás rexións flanqueantes do fragmento de ADN que se desexa amplificar (a diana). |
| Ciclo de PCR: en cada ciclo repítense os pasos desnaturalización – hibridación – extensión, duplicando cada vez o número de copias da diana. Por exemplo, despois de 25 ciclos obtéñense uns 225 = 33,5 millóns de copias |
| Desnaturalización: romper as pontes de hidróxeno que unen dúas cadeas complementarias de ADN para obter dúas cadeas de ADN monocatenario. |
| Diana: fragmento de ADN particular que se quere amplificar |
| Eucariotas: organismo celular no que o material xenético que forma os cromosomas está dentro dun núcleo. |
| Extensión: copiar as cadeas de ADN por medio da ADN polimerasa. |
| Hibridación: unir dúas cadeas complementarias de ADN monocatenario; por exemplo, os primers coa rexión flanqueante da diana. |
| PCR: reacción en cadea da polimerasa, das súas siglas en inglés Polimerase Chain Reaction. |
| RT-PCR: PCR na que primeiro se fai unha retrotranscrición e posteriormente unha PCR. |
| Retrotranscrición: o paso de ARN a ADN. |
| Transcrición: o paso de ADN a ARN. |
| Transcriptasa inversa ou retrotranscriptasa: unha enzima capaz de sintetizar unha cadea de ADN complementaria a partir dunha cadea simple de ARN. |
| Xenoma: o material xenético do virus. |
(Imaxe de portada: Extracción do coronavirus nun laboratorio, Flickr https://flic.kr/p/2iBv3gx)
