O visor de fluorescencia do kit DNA-Meat

O novo visor de fluorescencia fai visible o ADN presente nunha mostra despois do proceso de multiplicación por PCR.

Por: XuvenCiencia

No kit DNA-Meat multiplícase o ADN presente nunha mostra coa técnica de PCR uns millóns de veces ata obter unha cantidade suficiente para poder detectala. Aínda así, o ADN non é visible a ollo nin ten cor propia como para tinxir a disolución. Precisamos dunha forma de facelo visible que sexa rápida, sinxela e non moi cara.

O marcador fai visible a presencia do ADN multiplicado.

Unha das solucións que se usa nos laboratorios de bioloxía molecular é o marcaxe do ADN cunha molécula fluorescente. Estas moléculas marcadores soamente emiten luz fluorescente se están unidas ao ADN. Se non hai ADN en cantidade suficiente, os marcadores non poden unirse ás cadeas do ADN e non emiten luz. Hai unha multitude de marcadores fluorescentes diferentes para o ADN. No DNA-Meat usamos o laranxa de tiazol, unha molécula pequena que non é fluorescente en auga pura, pero que emite unha luz verde-amarela intensa en canto se une ao ADN.

O marcador soamente emite luz en presencia do ADN

De todos os xeitos: onde obtén o marcador a enerxía para emitir a luz fluorescente? Non pode emitir luz sen recibir a enerxía necesaria! Os marcadores fluorescentes obteñen a enerxía para emitir luz da absorción doutra luz; converten luz en luz doutra cor! Para que o noso marcador poida emitir a súa luz verde-amarela débil, temos que irradialo con luz azul moito máis intensa.

Se o marcador unido ao ADN absorbe luz azul, emite luz de fluorescencia verde-amarela.

Entón, necesitamos unha fonte de luz azul intensa e un xeito de poder observar a luz verde sen que nos cegue a luz azul. Como o conseguimos?

Para resolver este reto xuntámonos un equipo de especialistas de varias áreas da USC: unha química para a molécula marcadora, un biólogo para o ADN, un enxeñeiro de expresión gráfica para o deseño 3D, outro enxeñeiro de electrotecnia para a electrónica e un físico para o tema da luz e as cores.

Decidimos usar uns LED azuis de alta potencia para irradiar o marcador. Cantos fan falta e a que distancia os poñemos? Que tipo de LED ten suficiente potencia e un custo aceptable? Cal é a intensidade eléctrica óptima para os LED? Fixemos probas con varios modelos e con diferentes xeometrías e atopamos unha boa solución.

Para bloquear a luz azul e poder ver mellor a luz amarela moito máis débil necesitamos un filtro de cor que absorba e bloquee a luz azul, pero non a verde-amarela. Un filtro que deixe pasar o amarelo e vermello e non o violeta nin o azul ten unha cor laranxa como podemos ver na seguinte gráfica. Non deixa pasar moito o verde, pero si o amarelo.

O filtro laranxa absorbe o violeta, azul e parte do verde, pero deixa pasar a luz de cor verde-amarela, laranxa e vermella.

Despois de varias probas con diferentes fabricantes e materiais demos cun filtro de metacrilato laranxa coas características que necesitabamos. Pero observamos que os LED “azuis” non soamente emitían a luz azul intensa, senón tamén algo de luz de cor verde que entón atravesaba o filtro laranxa e confundíase coa luz de fluorescencia do marcador. Para “limpar” a luz dos LED engadimos tamén un filtro azul, que absorbe a parte verde da luz do LED.

O filtro azul absorbe a luz verde débil que emite o LED, pero deixa pasar a luz de azul intenso que necesitamos para irradiar o marcador.

Con todos o elementos elixidos e probados empezamos a deseñar a caixa do visor que mantén cada elemento no seu sitio. O visor debería permitir ver a mostra sen que molesten nin a luz azul ni a luz ambiental, e que sexa fácil de fabricar e montar. Decidimos crear a caixa nun programa de CAD no ordenador e despois imprimila cunha impresora 3D. Facían falla varias probas e melloras ata que chegamos a unha versión que cumpría con todos os requisitos.

Esquema do visor de fluorescencia. A luz azul non atravesa o filtro laranxa e soamente se observa a luz verde do marcador do ADN.

Os LED azuis irradian a mostra desde o lateral, case perpendicular ao eixe de visión. Así evitamos que chegue a luz azul directamente desde os LED aos ollos do observador e axudámoslle ao filtro laranxa na súa tarefa de bloquear esta luz.

A luz azul é moi intensa, pero non sae da caixa!

Como resultado podemos observar a luz verde-amarela do marcador sobre un fondo escuro, sen que moleste a luz azul. É a mesma técnica empregada nos aparellos profesionais para a detección de fluorescencia, os espectrofluorímetros. Tamén a emprega a policía científica cando ilumina unha escena dun crime con lanternas potentes de luz azul ou ultravioleta e obsérvaa a través de gafas laranxas. Permítelle bloquear a luz azul e soamente ver as manchas que emiten a luz fluorescente.

Soamente os tubos 2 e 3 conteñen ADN e emiten luz fluorescente. O filtro laranxa bloquea a luz azul, pero non a verde.

Despois das probas co prototipo e algunhas modificacións pequenas imprimimos e montamos a primeira serie de visores coa axuda da asociación MakersLugo. Todo un traballo en equipo!

As caixas do visor impresas en 3D, listas para a montaxe.

O visor forma parte do kit educativo de XuvenCiencia DNA-Meat con todo o material necesario para a realización da práctica na aula.

O kit DNA-Meat.

Deixa unha resposta

O teu enderezo electrónico non se publicará Os campos obrigatorios están marcados con *